聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實驗操作四個故障現(xiàn)象原因解析與解決辦法
日期：2021-10-18 | 中海生物技術(shù)文庫 | 瀏覽：1339 次
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)物質(zhì)的電泳技術(shù)檢測標(biāo)準(zhǔn)，通常情況下為兩天時間范圍之內(nèi)，最好能當(dāng)天檢驗完成，超過兩天后帶型不規(guī)律以至于消退。但有時候仍會與到如此這樣的現(xiàn)象，直接影響檢驗最終結(jié)果的判定，中海生物技術(shù)按照實際分類整理PCR(b1ss.cn)聚合酶鏈反應(yīng)實驗四個故障現(xiàn)象原因解析與解決辦法如下所述：
聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實驗操作四個故障現(xiàn)象原因解析與解決辦法
| 狀況 | 故障現(xiàn)象 | 原因分析 | 解決辦法 |
| ㈠無擴增物質(zhì) | 正比對有條帶，而樣本則無 |
①樣例:內(nèi)含抑制物，占比低 ②Buffer對樣本不適宜 ③引物設(shè)計不善或是會出現(xiàn)降解 ④反應(yīng)必要條件：退火溫度太高，擴展時長過短 |
?純化樣例或是采用檢測試劑盒獲取樣例DNA或增加樣例的用量 ?替換Buffer或調(diào)節(jié)濃度值 ?再次設(shè)計引物（避免出現(xiàn)鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或是換一管新引物 ?降低退火溫度、增加擴展時長 |
| ㈡非特異性擴增 | 條帶與預(yù)計的尺寸不一致或是非特異性擴增帶 |
①引物特異性差 ②樣例或引物濃度過高 ③酶量太多 ④Mg2+濃度值較高 ⑤退火溫度低于正常 ⑥反復(fù)頻次太多 |
?再次設(shè)計引物或是采用巢式PCR ?適度降低樣例或引物濃度 ?適度降低酶量 ?降低鎂離子濃度值 ?適度提升 退火溫度或采用二周期溫度法 ?降低反復(fù)頻次 |
| ㈢拖尾 | 物質(zhì)在凝膠上呈Smear狀況 |
①樣例不純 ②Buffer不適宜 ③退火溫度低于正常 ④酶量太多 ⑤dNTP和Mg2+濃度值較高 ⑥反復(fù)頻次太多 |
?純化樣例 ?替換Buffer ?適度提升 退火溫度 ?適量用酶 ?適度降低dNTP和鎂離子的濃度值 ?降低反復(fù)頻次 |
| ㈣假陽性 | 空白對照會出現(xiàn)目的擴增物質(zhì) | 靶序列或擴增物質(zhì)的交叉性污染 |
?基本操作的時候要注意柔和，以防將靶序列吸取到加樣槍內(nèi)或噴濺離心管外； ?除酶及不可以耐超高溫的物質(zhì)外，全部實驗試劑或器械均應(yīng)髙壓消毒殺菌。所使用離心管及加樣器槍頭等均應(yīng)一次性使用。 ?各種各樣實驗試劑最佳先完成分開包裝，隨后較低溫度貯藏 |
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