本文是中海生物技術(shù)zhzbio.c0m羊大腸桿菌培養(yǎng)基制備六大步驟解析：

Ⅰ、凍存液的制備

將含有足夠菌量的液體培養(yǎng)基進(jìn)行離心后，沉淀過(guò)程中加入等量的40%甘油，置于-80°C冷凍。

Ⅱ、培養(yǎng)基制備

LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨Trypton：10 克/升、酵母提取物YeastExtract：5 克/升、氯化鈉NaCl：10克/升、 pH7.4。

液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10克、酵母粉5克、氯化鈉 10克、水1000毫升、 pH7.4。

固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%~2.0%瓊脂

Ⅲ、平板的制備

⒈稱(chēng)取10.0 g胰蛋白胨、5.0g酵母粉、10.0g氯化鈉，加800mL二次水溶解，用玻璃棒攪拌均勻，用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4左右，定容至1L，調(diào)節(jié)pH至7.4 如果溶液pH大于7.4，用1mol/LHCl調(diào)節(jié)。

⒉分裝到實(shí)驗(yàn)錐形瓶中。每瓶放入用量不宜過(guò)多，應(yīng)在瓶底下方二厘米左右。如果需要固體培養(yǎng)基，分裝后在液體培養(yǎng)基中加入約2%瓊脂，即150毫升中 海液體培養(yǎng)基中加入2.5g瓊脂。

⒊用塑料薄膜蓋住錐形瓶口依次將濾紙透氣孔和硬紙，用橡皮筋扎好。用記號(hào)筆標(biāo)明培養(yǎng)基名稱(chēng)和制備日期，所有錐形瓶的操作如上所述。

⒋中海使用121°C高壓滅菌15分鐘。

⒌取出滅菌培養(yǎng)基放置置于60℃電鼓風(fēng)干燥機(jī)中烘干，等錐形瓶封口紙干燥后取出。液體培養(yǎng)基可以直接儲(chǔ)存使用。因瓊脂培養(yǎng)基不會(huì)凝固。您可以通過(guò)紫外線消毒三十分鐘以上的無(wú)菌操作平臺(tái)上，把中'海培養(yǎng)基倒入在培養(yǎng)皿中約4mm厚度約10-15mL，直徑90mm，將培養(yǎng)皿堆疊在無(wú)菌操作臺(tái)上并放置約十分鐘。然后等瓊脂基本凝固后，就能涂抹到平板上了。

⒍如果平板不是即時(shí)使用，需把中海培養(yǎng)基滅菌后存放在錐形瓶中。當(dāng)需要平板制備時(shí)，在微波爐中用中火檔位加熱約三分鐘易融化瓊脂，室溫環(huán)境冷卻二十分鐘確保不燙手再進(jìn)行制備平板。

Ⅳ、接種大腸桿菌

①取實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌BL21凍存液，用酒精燈灼燒管口，打開(kāi)離心管。

②接種方法1：用無(wú)菌移液器吸頭蘸取凍存液，在板邊緣畫(huà)一條橫線，每三個(gè)車(chē)道為一組，將盤(pán)子旋轉(zhuǎn)一次，最后在中間畫(huà)一個(gè)鋸齒形；接種方法2：用吸管吸取100uL溶液放在平板上，用酒精燈消毒的厚涂片棒劃十字涂在平板上。

③因?yàn)閷?shí)驗(yàn)一般需要挑取單個(gè)菌落，涂抹平板的操作需考慮冷凍液中細(xì)菌的數(shù)量。若菌量過(guò)多，應(yīng)適當(dāng)稀釋。通常方法一更容易獲得單個(gè)菌落，涂抹平板應(yīng)靠近酒精燈操作。如果平板上涂有冷凍保存液，應(yīng)將其倒置以防止平板表面產(chǎn)生水蒸氣。

Ⅴ、羊大腸桿菌的培養(yǎng)

①將接種板倒置，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中。約十小時(shí)后菌落生長(zhǎng)。

②挑出生長(zhǎng)狀態(tài)良好、特征明顯的單菌落，接種于新鮮滅菌的中.海LB液體培養(yǎng)基中，220轉(zhuǎn)/分+37℃恒溫振蕩培養(yǎng)9~12小時(shí)。菌落呈乳白色和圓形特征，菌落邊緣整齊，表面光滑，表面顏色與背面顏色一樣。

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